PAK li spite

Ami imam ideq da poosvejim kluba ne6to.Naposledak mnogo e zaspal.Daite nqkoi stimul sus zagadka ili vupros4e de!6te 4akam a moje i sam da pratq nqkoe vupros4e.Ama da ne si otgovarqm sam!!

Ami hajde zadaj niakoe vypros4e, moze pyk i da stame interesno!

Айде да ви видя:
На кои видове са секвенирани изцяло геномите до сега?

Истината е привилегия на глупаците.

A sega de! Ami 4estno kazano ne moga da se setia za vid s izcialo sekveniran genom. Mislia si....... abe na Drzophila ne be6e li sekveniran?...... Oh, izvini me ako sym kazala goliama glupost..... ne sym sigurna.

A ti mi kazi koi sa metodite za sekvenirane,koito naj-4esto se izpolzvat

na mnogo:

[линк]

sigurno ima i niakoi microbni genomi deto ne sa publikuvani

:)
Добре това ще го считам за верен отговор, въпреки че ако съм честна очаквах таксономични имена. И все пак е доре и така.

Истината е привилегия на глупаците.

ami az pyk ne sym mnogo dobre s taq 4ast
mislq 4e se puskat wyw sekwenatori a ako trqbwa da se prawi babe6kata ili po-to4no bednia6kata se prawi s agarozna elektrophoreza

a za genomite sa sekwenirani na 4owek (Homo sapiens), Arabidopsis thaliana, drogdi (Saccharomyces cerevisiae), edin namatod (Caenorhabditis elegans) + o6te 400 mikroorganizmi
a w proces sa drozofilkata i mi6kata (ot modelnite po izwesni organizmi)

Истината е привилегия на глупаците.

Maj sym napisala golqma glupost!
Dnes goworih s kolegi i se okaza 4e nqma ni6to ob6to.

Истината е привилегия на глупаците.

Za koe kazvash che si sgreshila?
Sega kato proshetoh, tova koeto si napisala si spomnih, che imashe takova neshto (za Arabidopsis i za drozdire), tova za moikroorganizmite - znam che na mnogo sa sekvenirani (bez da znam tochnata brojka de).
Blagodaria vse pak che mi pripomni. Maj dosta neshta sym pozabravila

Hubavo bi bilo da se zaformi tuk interesna diskusia, no vsichki vyprosi, koito me vylnuvat ot molekuliarnata genetika da takiva, che edva li sa interesni za po-shiroka publika.

Vse pak iskata da zaformim edna profesionalna diskusia, moga da spodelia prblema s koito se brychkam v momenta:

Znachi triabva da kloniram 4 gena vyv plazmid proizvoden na pBin19, no dosta ugolemen za da se postviat 4 kopia na regulatorni sekvencii mejdu 35S i multiple cloning site (sorry v tazi kysna vecher ne mi se prevejda ot English). bez da vi ottegchavam s podrobnosti plasmida e stanal mnogo goliam - nad 12 Kb. Seha sled restrikcionno riazane ne moga da go prechistia. Probvah vsiakavi kitove za direktno prechistvane i prechistvane sled agarozna elektroforeza na banda ama navsiakyde se zakache na kolonite i si ostava tam.

Niakoi moje li da mi predloji ideia, metod, kit za takiva golemi vektori, tribava da go polucha koncentriran v H2O che da go polzvam za legirane???

Има няколко начина, кой от кой по-лесни.
1. най-лесният е кита на Qiagen QiaEx II (това е този със стъклените зърна). Има една тънкост, за да елуираш фрагмента трябва смолата с буфера за елуиране да се държи 15-20мин на 50 градуса (това си го пише в упътването). Кита с колоните не става за такива фрагменти и това пак си го пише в упътването.
2. Пускаш го на нискотопима агароза и правиш стандартната екстракция с горещ фенол
3. Пак от нискотопима агароза, го вадиш с агараза
4. Най-мързеливият начин е просто да натрошиш гела, да го центрофугираш и да прибереш водата отгоре. Добивът не е много голям но за едно клониране все ще има.

С големите фрагменти (не че твоя е много голям) има и още една тънкост - ако оцветяваш гела с етидиев бромид и го гледаш на UV шанса да повредиш фрагмента, така че после да не става за клониране е доста голям, дори ако използваш дългвълнов трансилюминатор. Затова най-добре е да ползваш кристал виолет за оцветяването.

Много ми е чудно как ще секвенираш каквото и да било с агарозна електрофореза.

Blagodaria za ideite,

Se vidia kakvo ima na razpolojenie i ste probvam. Naistina 12 Kb ne e kaiznae kalko goliam vektor i zatova se vidiah v chudo.
Probvah s:
=RapidGel Extraction Kit;
=QLAquick Gel Extraction Kit;
=JET quick Gel Extraction Kit;
= Freeze&Squize Quantum Exctarction Spin Columns
i = GenElute Minus EtBr Spin Comulns
a, da i da ne zabravia - "napravi si sam" Spin Comuln - t.e. dve ependprfki edna v druga gornata sriazana na polovina s probito dyno i malko styklena vata vyrhu koiato da sloja gela.

Na vsichki izbroeni po-gore kitove pishe v che bez problemi mogat da izolirat fragmeti ot 50 bp do 50 Kb t.e. moia ne e nisto osobono, no dori na toplo (75oC) ne se otkacha.

Qiagen QiaEx II naistina e dobyr, no v tukashnata laboratoria go niamam: Ste probvam niakoi ot drugite varianti.


Vsystnost ne sym syvsem tochen - Freeze&Squize dava kym 30% dobiv, no restriktazite tuk sa kupuvani na parche za drugu klonirania i v kombinaciata v koiato az triabva da gi polzvam tribava da pravia mejdinnno prechistvane i v kraina smetka ot vectora ostava po-malko ot nisto.

O.K. deistvam dani tozi pis stane...

Abe hora, vie ste bili mnogo napred s materiala!!!
Za pryv pyt vlizam v tozi klub i vizdam profesionalisti!!!
Az si mislih che povecheto sa kato men (chuvali niakoga za niakoi raboti)

Zdravei Ms.Blie,

Az zatova ne iskah da puskam mnogo specifichni temi za diskusia, no sym na goliam zor - toia typ plasmid mi trovi jivota veche edin i polovina meseca. Uj nisto rabota pyk kato se zakuchi....

Naistina iskah da vidia kakvi reshenia mogat da mi predlojat . V momenta probvam edno ot predlojeniata...

Niama losho, che puskash po-specifichni temi za diskusia. Dori naprotiv, taka bi triabvalo da e v edin takyv klub. Loshoto e che si misleh che i az ponaznajvam niakoi neshta, a se okaza che sym dalech ot istinata Eh, uchila sym molekuliarna genetika predi 3 godini i to ne tolkova zadylbocheno. Interesno mi e kakvi geni klonirash (ako ne e tajna)

Qiaquick кита със сигурност не става за повече от 10kbp, за другите не знам. Тези китове които само изтискват агарозата са пълен боклук, защото остават агарозни фрагменти, които след това скапват лигазата.
Защо трябва да правиш междино пречистване от гел междо отделните рестрикази? Обикновено е достатъчно да преутаиш реакцията и чак накрая си изрязваш от гел необходимия фрагмент. Пък и винаги можеш да нарежеш 20-30мкг и при 95% загуба накрая ще имаш достатъчно за 10-20 клонирания.

Ne mislia che e chak takava taina

Triabva da se klonirat dva gena kodirasti kluchovi enzimi ot biosynthetichnia pyt na artimizina. Tova e analog na hinina i se polzva kato lekarstvo protiv malaria. Ideata e da se napravi dostatychno ustoichiva linia transgenni suspenzialni kletychni kulturi, koito da proizvejdat produkta.

Osven tova triabva da se prigotvi i fusion na dvata gena taka che sled transformacia da se ekspresira fusion protein, koito da sychetava prostranstveno blozo dveta enzimni aktivnosti.

Genite i fusiona gi mam kato cDNA i koloniraniu v drugi plasmidi, ama tozi plasmid mi vzema zdraveto.

Kato si e cial nikakvi problemi s izoliraneto. Sled kato go rezna s restriktaza obache ne moga da go hvana. Na gel se vijda tam si e ama kakto i da go lyja vse se zakacha niakyde. Ako prosto go precipitiram pyk ne ste da se raztvori posle. Ima nesto gnilo s tozi ogromen tetramer deto sa mu go vkarali mejdu promotora i multipe cloning site .

Predi malko probvah edin metod i sega kloniram utre ste vidia kakvi sym gi zabyrkal toia put.

Za preutaiavaneto - tova beshe pyrvoto nesto, koeto probvah, no za razlika ot insytrite, i drugite plazmidi toia gaden plazmid sled utaiavane ne iska da se raztvori. Probvah razni trikove - ne ste i ne ste. E, ne che toi na parcali no kato pusnesh niakolko mkl na gel si stoi na starta. 10-15% otivat nadulu ostanalite ne myrdat. Podoziram che tetramera , koito sa mu vkarali mi igrae niakavi nomera.
Sega se setih - toi e vkaran s restr. sites EcoRI i XmaI ste vzema da go rezna i da widia kak ste se dyrji plazmida, ama tova ne mi reshava problemite.

A inache za 20-30 mkg!!!! Abe v tvoiata labatoria da ne bi da ste napravili transgenni rastenia deto imat vmesto lista - dolari (Maitap de)

Az tuk ako izpolzwam poveche ot 1-2 edinici za 1 restrikcia i me iziajdat s parcalite. Kak da reja poveche ot 1 mkg? To ot tia nesta sa problemite.
Abe gadno e che i zapadno-evropeicite go udariha na ikonomii. Te mai ne se nauchiha ot nashia opit che "Ikonomiata e maika na mizeriata"
Ako ne se opitvaha da ikonomisvat stiah pyrso da si porycham i dvete restriktazi (po 10 000 Units) ot Stratagen tam gi preglagat s Uni-Buffer i ne mi tribva nikakvo mejdunno prechistvane..... Osven da proveria systava i da si napravia buffera

Ste probvam nikoi ot ideite koito mi dade dano trygne. Predvaritelno blagodaria

Do skoro!

Ej, mnogoznajkovciiiii ne moga da se vkliuchia vyv razgovora vi neshto!A iskaaaaam Iskam da mi napravite kloning, samo da e po umen ot men